INTRODUCCIÓN

La cavidad bucal supone una vía de entrada, de infección y de transmisión de microorganismos, incluyendo el coronavirus SARS-CoV-2. Diversos investigadores han propuesto que el uso de colutorios con determinados antisépticos podría reducir la carga viral en la cavidad bucal y de esta manera, ayudar a minimizar la transmisión del virus, lo cual es especialmente relevante por la gravedad de la enfermedad que genera (COVID-19) y por la proliferación de las variantes del virus que puedan aparecer.

OBJETIVO

El objetivo del presente estudio preclínico es la determinación de la capacidad de degradación del SARS-CoV-2 por parte de varios colutorios portadores de Cloruro de Cetilpiridinio (CPC) y la evaluación del impacto en la disminución de la infectividad de dos variantes del virus, B.1.1.7 y D614G.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se realizaron 4 experimentos:

• Reducción de entrada de pseudovirus de SARS-CoV-2 a células humanas HEK-293T

Se analiza la capacidad del CPC de impedir la entrada de un pseudovirus de SARS-CoV-2 a células HEK-293T.

Para ello se utiliza un lentivirus modificado genéticamente para expresar la proteína Spike de dos variantes, B.1.1.7 y D614G, del SARS-CoV-2. Los lentivirus se contactan durante un minuto con los colutorios portadores de CPC o con sus vehículos. Posteriormente, y mediante luminiscencia (reacción de la enzima luciferasa), se cuantifican las interacciones de la proteína Spike de los lentivirus con su receptor de unión, la proteína ACE2, presente en la superficie de las células HEK-293T.

• Mecanismo de acción del CPC

Se analiza la capacidad de colutorios con CPC de degradar la envuelta lipídica de las variantes de SARS-CoV-2 B.1.1.7 y D614G.

Para ello, se contactan durante dos minutos, un colutorio con CPC al 0,07% o su vehículo y las suspensiones de las variantes de SARS-CoV-2 B.1.1.7 y D614G (volumen 1:1). Posteriormente, se mide en los sobrenadantes la cantidad de nucleoproteína del virus mediante ELISA.

• Reducción de la capacidad de infección de SARS-CoV-2 en células VeroE6

Se evalúa la capacidad de colutorios con CPC o bien sus vehículos de reducir la infectividad (TCID50) de las variantes de SARS-CoV-2, B.1.1.7 y D614G.

Para ello, las dos variantes del SARS-CoV-2 se contactan durante 1 y 2 minutos con un colutorio con CPC o bien con su vehículo, en volúmenes 1:1. Posteriormente, se determina la capacidad infecciosa de los virus tratados calculando la dosis infecciosa necesaria para matar a la mitad de la población de células VeroE6 (TCID50).

• Capacidad del CPC de ejercer su actividad antiviral en presencia de saliva esterilizada.

Por último, se evalúa la actividad antiviral del CPC frente a la variante B.1.1.7 de SARS-CoV-2 en presencia o ausencia de saliva.

Se utiliza un colutorio con CPC 0,07% o bien medio de cultivo, se contactan con la variante B.1.1.7, en presencia o ausencia de saliva esterilizada de un donante no vacunado y COVID-19 negativo.

Se valoraron los virus en células VeroE6 para determinar la infectividad (TCID50) en presencia o en ausencia de saliva esterilizada.

Los colutorios utilizados en los experimentos fueron:

• Colutorio A: CPC 0,05%
• Colutorio B: CPC 0,07%
• Colutorio C: CPC 0,05% + Clorhexidina (CHX) 0,12%

Se utilizaron como controles los vehículos de los colutorios A, B y C. Es decir, las mismas formulaciones, pero sin CPC.

RESULTADOS

• Reducción de entrada de pseudovirus de SARS-CoV-2 en células HEK-293T

Los colutorios con CPC fueron capaces de inhibir la fusión viral de las variantes B.1.1.7 y D614G del SARS-CoV-2 s, de forma dosis-dependiente a concentraciones no citotóxicas, reduciéndose en más de un 60% la entrada viral respecto a los vehículos, que no mostraron actividad inhibitoria. De esta manera, se señala al CPC como el ingrediente antiviral presente en los colutorios.

• Mecanismo de acción del CPC

Las proteínas de la nucleocápside de los virus tratados con el colutorio con CPC 0.07% fueron detectadas en niveles mucho más elevados que en el vehículo, con independencia de la variante utilizada (B.1.1.7 y D614G). Se demuestra de esta manera que el CPC fue capaz de degradar de forma muy efectiva las membranas virales de las variantes de SARS-CoV-2 analizadas, confirmando por tanto que el mecanismo de acción del CPC sobre SARS-CoV-2 consiste en la degradación de la envuelta lipídica.

• Reducción de la capacidad de infección de SARS-CoV-2 en células VeroE6

Los colutorios con CPC (A,B y C) fueron capaces de reducir 1.000 veces la infectividad (TCID50) de las variantes B.1.1.7 y D614G de SARS-CoV-2 tras 2 minutos de contacto, mientras que los vehículos no tuvieron impacto. Se verificó, además, que los colutorios utilizados no tuvieron efectos citotóxicos sobre las células VeroE6.

El CPC, por tanto, ejerce una actividad antiviral sobre SARS-CoV-2, y los colutorios con CPC tienen la capacidad de reducir 1.000 veces la infectividad de un stock viral tratado en un volumen 1:1 durante 2 minutos. Con el objetivo de asemejarse a las condiciones de uso normal de un colutorio, la actividad antiSARS-CoV-2 del CPC se estudió tras 1 minuto de contacto entre el colutorio y los virus, observándose nuevamente reducciones de 1.000 veces en la infectividad del virus.

• Capacidad del CPC de ejercer su actividad antiviral en presencia de saliva esterilizada

El tratamiento de la variante B.1.1.7 con el colutorio con CPC 0.07% (colutorio B, volumen 1:10) en presencia de saliva esterilizada (en un volumen 1:1) produjo una reducción de 10 veces la TCID50 por mililitro de B.1.1.7 en comparación con los virus no tratados. El CPC, por tanto, no alteró su actividad antiviral tanto en presencia como en ausencia de saliva.

CONCLUSIÓN  

Los colutorios con CPC redujeron, en condiciones in vitro, 1.000 veces la infectividad de las variantes B.1.1.7 y D614G del SARS-CoV-2 tras 1 y 2 minutos de contacto. El CPC fue efectivo a bajas concentraciones y en presencia de saliva. El CPC, por su mecanismo de acción, sería eficaz frente a todas las variantes actualmente descritas del virus.